Ideale Real-time PCR-Signale mit optimierten Mikrotiterplatten

Für die Real-time PCR im 96-Well-Format gibt es eine Vielzahl an Mikroplatten verschiedenster Hersteller. Der größte Unterschied zwischen den PCR-Platten besteht in ihrer Farbe. Die Bandbreite reicht von transparenten bis hin zu undurchsichtigen schwarzen und weißen Platten. Transparente Mikroplatten bieten dem Anwender eine bessere Sichtbarkeit der Flüssigkeiten und sind daher sehr benutzerfreundlich. Schwarze Platten zeichnen sich durch das geringste Hintergrundrauschen aus. In Bezug auf Performance stechen jedoch die weißen Mikroplatten hervor.
Transparente Platten haben Probleme mit der Lichtstreuung, die durch die Plastik selbst verursacht wird. Das führt zu einer geringeren Signalintensität. Die weißen Platten hingegen haben den gegenteiligen Effekt. Die Plastik verstärkt die Signale und Ct-Werte der Real-time-Assays, da das Licht in den Wells reflektiert wird. Für Labore hat dies bedeutende Vorteile, da sie durch den Einsatz optimaler Platten ihre Real-Time-PCR- Ergebnisse verbessern können, ohne das zusätzliche Kosten oder Arbeitsaufwand entstehen.
Unter Verwendung eines E. coli K12 Plasmids und eines K12-genspezifischen Primers soll aufgezeigt werden, wie mit weißen Mikroplatten bis zu viermal bessere Real-time PCR-Signale erreicht werden können.

Material und Methoden

Der RT PCR Mix SYBR® von A&A Biotechnology diente als Mastermix für die Amplifikation der Ziel-DNA. Ein E. coli K12 Plasmid (1x 10⁶ Kopien) wurde als DNA-Probe verwendet, während spezifische Primer für E. coli K12 zur Amplifikation eingesetzt wurden. Zusätzlich kamen Wasser für molekularbiologische Anwendungen sowie eine weiße und eine transparente 96-Well-Mikrotiterplatte mit einem Volumen von 0,2 ml Volumen pro Well zum Einsatz. Der verwendete Mastermix enthält eine sehr spezielle Taq-DNA-Polymerase, die keiner zusätzlichen Aktivierung bei 95 °C bedarf. Der Mix wurde auf den gängigen Real-Time-PCR-Instrumenten validiert und kann verschiedene DNA-Templates detektieren – genomische, cDNA sowie virale Sequenzen. Dieser Mix eignet sich besonders gut für die Detektion niedriger DNA-Mengen, da die proprietäre Technologie das Entstehen von Primer-Dimeren und unspezifischen Produkten verhindert und somit eine erhöhte Sensitivität und Spezifität der Reaktion gewährleistet.

Probenvorbereitung

Tabelle 1 zeigt die Vorbereitung des qPCR-Mastermixes im Detail für eine Probe.

	Stammlösung	Endkonzentration	Volumen
A&A Biotechnology RT PCR Mix SYBR®	2x	1x	10 μl
E. coli K12 Plasmid	1x106 Kopien 1:10 Verdünnung	-	0,2 μl
E. coli K12 specific primer FWD	50 μM	0,5 μM	0,2 μl
E. coli K12 specific primer REV	50 μM	0,5 μM	0,2 μl
Ultrareines Wasser			9,4 μl

 

Tabelle 2 zeigt die Vorbereitung der Verdünnungsreihe.

Verdünnung	Volumen Plasmid	Volumen Wasser	Endkonzentration
Verdünnung 1	1 μl Plasmid	9 μl	1x 106 Kopien
Verdünnung 2	1 μl von Verdünnung 1	9 μl	1x 105 Kopien
Verdünnung 3	1 μl von Verdünnung 2	9 μl	1x 104 Kopien
Verdünnung 4	1 μl von Verdünnung 3	9 μl	1x 103 Kopien
Verdünnung 5	1 μl von Verdünnung 4	9 μl	1x 102 Kopien
Verdünnung 6	1 μl von Verdünnung 5	9 μl	1x 101 Kopien

 

Instrumentierung

Für die Messung wurde ein qTOWER iris Real-Time-PCR-Thermocycler verwendet, ausgestattet mit Farbmodul 1 (Excitation: 455 nm / Detektion: 515 nm).

Tabelle 3 zeigt das Temperatur- und Zeitprotokoll.

Schritt	Zyklus	Profil	Temperatur	Haltezeit	Ramping-Raten
1	1	Initiale Denaturierung	95 °C	2 min	Max.
2	Insgesamt 50 Zyklen aus Denaturierung, Anlagerung und Elongation	Denaturierung	95 °C	5 s	Max.
2		Anlagerung	58 °C	5 s	Max.
2		Elongation	72 °C	20 s	Max.
3		Schmelzkurve	60 °C – 95 °C

 

Ergebnisse und Fazit

Die Abbildung 1 zeigt die Amplifikationsplots für eine zehnfache Verdünnungsreihe von 10⁶ bis 10¹ Kopien unter Verwendung eines E. coli K12 Plasmids und eines K12-genspezifischen Primers. Die Fluoreszenzintensitäten sind für die weißen Mikroplatten (schwarze Kurve) im Vergleich zu den transparenten Mikroplatten (rote Kurve) mehr als viermal höher. Die weißen Platten optimieren die Lichtmenge, die zum Detektor zurückgeführt wird. In der Praxis bedeutet dies, dass sich die Intensität und die Sensitivität der Real-Time-PCR-Assays erhöhen. Somit können auch geringe Mengen, also eine niedrige Zahl an Kopien, detektiert werden. Auch die Ct-Werte sprechen eine eindeutige Sprache: Innerhalb von zwei Zyklen zeigen die Proben in den transparenten Mikroplatten deutlich höhere Ct-Werte an (siehe Tabelle 4). Die weißen Platten bieten also auch hier eine bessere Performance.

Tabelle 4 zeigt die Ct-Werte im Vergleich.

	Kopienanzahl	Durchschnittlicher Ct-Wert (Transparent)	Durchschnittlicher Ct-Wert (Weiß)	Δ Ct
D1	106	13,81	10,82	2,99
D2	105	16,88	13,89	2,99
D3	104	20,64	17,55	3,10
D4	103	24,28	20,88	3,40
D5	102	27,54	24,24	3,30
D6	101	30,98	27,71	3,27

Weitere Informationen:

Dieser Blogbeitrag entstand mit freundlicher Unterstützung der Firma Analytik Jena GmbH+Co. KG.
Quelle aller Bilder: Analytik Jena GmbH+Co. KG

Weitere Informationen zum qTOWER iris Real-Time-PCR-Thermocycler von Analytik Jena finden Sie in dieser Broschüre.