Die häufigsten Fehlerquellen der manuellen Zellzählung

Was ist manuelle Zellzählung? Bei der Zellzählung handelt es sich um eine Routinemethode der Laborarbeit, welche durchgeführt wird, um zu bestimmen, wie viele Zellen sich in einer Probe befinden. Auf diese Weise kann das Wachstumsverhalten der Zelllinie beobachtet werden. Dies ist wichtig, wenn eine bestimmte Zellzahl zum Ansetzen eines Versuchs erreicht werden muss oder aber, um den Einfluss verschiedener Faktoren auf das Wachstum der Zellen zu überprüfen (Schmitz, 2011).

Zur manuellen Zellzählung werden meist Zählkammern, sogenannte Hämocytometer, herangezogen. Vor dem Auftrag auf die Zählkammer wird oftmals eine Trypanblau-Färbung durchgeführt, wobei ein Aliquot der Zellsuspension mit dem Farbstoff Trypanblau gemischt wird. Dieses färbt tote Zellen blau, während lebende Zellen ungefärbt bleiben. Auf diese Weise können unter dem Mikroskop die toten von den lebenden Zellen unterschieden werden.

Häufig wird zum Zählen die Neubauer Zählkammer verwendet, es gibt jedoch auch andere Kammern, die sich in ihren Quadraten unterscheiden.

Auf der Neubauer Zählkammer befindet sich ein Raster mit vier großen Quadraten, die in jeweils 16 weitere eingeteilt sind. Bevor sie zum Einsatz kommt, werden die Zählkammer, sowie das Deckgläschen mit Alkohol gereinigt. Im Anschluss wird das Deckglas etwas befeuchtet. Dies erfolgt meist durch Anhauchen, woraufhin es auf der Zählkammer platziert wird, sodass es gut haftet und nicht abfällt.

Im nächsten Schritt ist es wichtig die Probe zu mischen, bevor ein Aliquot entnommen wird. Ebenso erfolgt ein gutes Durchmischen, nachdem Trypanblau hinzugegeben wurde und kurz bevor der Auftrag auf die Zählkammer stattfindet. Es werden nur wenige Mykroliter des Aliquots auf den Rand der Neubauer Zählkammer aufgetragen. Hierbei muss die Flüssigkeit jedoch den Rand des Deckglases berühren, sodass sie dank der Kapillarkräfte hineingezogen wird und die Kammer vollständig befüllt. Anschließend können die Zellen bei einer geeigneten Vergrößerung gezählt werden. Dabei werden vier große Quadrate, bzw. 4×16 kleine Quadrate gezählt.

Bei der Zählung werden die Zellen innerhalb, sowie die sich auf dem linken und unteren Rand eines Quadrats befindenden Zellen gezählt. Dies verhindert, dass Zellen, welche sich zwischen zwei Quadraten befinden, doppelt gewertet werden. Anhand des Mittelwertes der vier großen Quadrate und unter Miteinbezug des Kammerfaktors (10⁴ bei Neubauer Zählkammer), des Verdünnungsfaktors und des Volumens, in dem sich das Zellpellet befand, kann die Gesamtzellzahl in der Gesamtprobe berechnet werden. Dank der Trypanblau-Färbung können ebenso Aussagen über die Vitalität der Zellen getroffen werden. (Schmitz, 2011)

Die vier häufigsten Fehlerquellen der manuellen Zellzählung

Immer noch ist das manuelle Zählen der Zellen mittels Zählkammer in vielen Laboren stark vertreten. Diese Methode birgt allerdings einige potenzielle Fehlerquellen in sich. Zu den häufigsten, vermeidbaren Fehlerquellen zählen:

1. Fehler bei der Handhabung und Vorbereitung

Es reichen bereits kleine Ungenauigkeiten in der Handhabung oder Vorbereitung der Probe, die später zu Fehlern bei der Auswertung der Ergebnisse führen können. Hierbei kann es sich um einen einfachen Pipettier- oder Verdünnungsfehler handeln, der im Laboralltag schnell passieren kann. Zudem genügt es, dass die Probe vor dem Auftrag nicht richtig durchmischt wird und zu wenige Zellen in die Zählkammer gelangen. Ebenso kann es dazu kommen, dass bei schlechter oder keiner Durchmischung die Pipette zu tief in die Probe bei der Entnahme eintaucht, sodass sich eine deutlich zu stark erhöhte Anzahl an Zellen in der Zählkammer befindet. Beide Fälle führen zu verfälschten Ergebnissen.

2. Das Erkennen der Zelle

Dieser Faktor führt häufig dazu, dass beim Zählen derselben Probe durch mehrere Personen, es zu unterschiedlichen Ergebnissen in der Anzahl der Zellen kommt. Grund hierfür ist, dass unter dem Mikroskop Zellen leicht mit Zelltrümmern, Kontaminationen oder anderen Fremdkörpern verwechselt werden können. Daraus folgt, dass Zellen mitgezählt werden, die eigentlich keine sind oder dass sie nicht gezählt werden, aufgrund von Verwechslung mit anderen Partikeln. Hierbei kann die Selektion mit dem bloßen Auge schwerfallen.

3. Toxizität von Trypanblau

Trypanblau gehört zur Gruppe der Azofarbstoffe und bindet sich an Zellproteine. Tote Zellen besitzen keine intakte Membran, weshalb der Farbstoff hineingelangen kann. Bei lebenden Zellen kann das Trypanblau die Membran nicht passieren, da das Molekül zu groß ist. Allerdings birgt der Farbstoff zwei Gefahren. Zum einen führt eine zu hohe Konzentration an Serum/Proteinen dazu, dass das Trypanblau an die Proteine im Serum bindet, wodurch die Selektion erschwert wird. Weiterhin wirkt der Stoff zytotoxisch bei einer zu langen Einwirkzeit. Somit steigt mit vergehender Zeit die Zahl der toten Zellen und es kommt zu verfälschten Ergebnissen (Schmitz, 2011).

4. Müdigkeit, mangelnde Konzentration und Ablenkung

Durch die Zellzählung soll das Wachstumsverhalten der Zellen beobachtet werden. Oft erfordert dies eine mehrmalige Kontrolle am Tag. Besonders ermüdend ist es, wenn mehrere Ansätze überprüft werden müssen. Nach einer längeren Zeit führt das helle Licht des Mikroskops häufig dazu, dass es für das Auge anstrengend wird hindurchzusehen. Unterstützt wird dies, wenn es sich um einen langen Labor Tag handelt und die Konzentration schwindet. Bei mangelnder Konzentration oder durch Ablenkung kann es außerdem dazu kommen, dass eine falsche Anzahl an Zellen gezählt wird oder nochmal von vorne gezählt werden muss, wodurch viel Zeit verloren geht.

Vorteile der automatisierten Zellzählung mit dem R-300

Im Vergleich zum manuellen Zählen bieten automatische Zellzähler wie das fluidlab R-300 viele Vorteile, die auch potenzielle Fehlerquellen des Zählens mit einer Zählkammer beseitigen können.

Beispielsweise besitzt das fluidlab R-300 ein großes Field of View (FoV), in dem mehr Zellen erkannt werden können. Das bedeutet für Sie eine höhere statistische Sicherheit bei den Ergebnissen Ihrer Messungen. Durch den Algorithmus können zusätzlich noch manuelle Fehler in der Zellzählung vermieden werden, sodass die Verlässlichkeit der Ergebnisse bei bis zu 20 Sekunden Zählzeit noch erhöht werden kann.

Zudem ist das Schweizer Taschenmesser des Laboralltags kompakt und portabel. Mit seinem geringen Gewicht kann es auch in hektischen Zeiten ortsunabhängig eingesetzt und mitgenommen werden. Dabei ist sogar die flexible Nutzung unter der Clean Bench oder der Glovebox möglich.

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Weitere Informationen

Dieser Artikel entstand mit freundlicher Unterstützung von anvajo. Quelle aller Bilder: anvajo

Literaturverzeichnis

Schmitz, 2011. Der Experimentator: Zellkultur. Hrsg. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag, 3(13), 207 ff.