Handling von Flüssigkeiten in der PCR Probenvorbereitung

Die PCR (Polymerase Chain Reaction) spielt in den unterschiedlichsten Bereichen eine wichtige Rolle. Egal ob in der Medizin, der Genforschung oder in der Lebensmittelüberwachung; bei der Durchführung einer PCR steht der Anwender vor der Herausforderung, kleinste Volumina äußerst genau zu dosieren. Keine einfache Aufgabe, wenn die Flüssigkeiten unterschiedliche physikalische Eigenschaften aufweisen.

Spätestens in der Corona-Pandemie hat jeder den Begriff PCR-Nachweis gehört. Aber wie funktioniert eine PCR genau? Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein enzymbasiertes Verfahren zur Vervielfältigung von DNA in vitro. Sie umfasst drei Schritte: Denaturierung, Anlagerung  und Verlängerung. Die Hauptanforderungen sind dabei zuverlässige Ergebnisse mit kleinsten Probenvolumina in kurzen Zykluszeiten zu erhalten. Um bei der Durchführung Zeit zu sparen und Pipettierfehler zu vermeiden, empfiehlt es sich, einen Mastermix anzusetzen. Dieser stellt sicher, dass allen DNA Proben derselbe Reagenzienmix zu Grunde liegt. Trotzdem bleiben folgende Herausforderungen bestehen:

• Kleine Volumina mit hoher Genauigkeit und Präzision zu dosieren
• Gefahr der Probenverwechslung muss auf ein Minimum reduziert werden
• Benötigte Flüssigkeiten haben verschiedene physikalische Eigenschaften
• Beanspruchung des Daumens beim Pipettieren sollte minimiert werden

Die Wahl des optimalen Liquid Handling Gerätes

Es stellt sich daher die Frage nach dem „richtigen“ Liquid Handling Gerät für die Anwendung. Doch welche Faktoren müssen hier berücksichtigt werden?

Zunächst bestimmt die Probenmenge und das demnach gewählte Format, ob eine Ein- oder Mehrkanalpipette effizienter ist.  Mit der Auswahl des richtigen Verbrauchsmaterials lassen sich Kosten und Zeit sparen und nebenbei die Abfallmenge reduzieren. Die Bandbreite reicht hier von Einzelgefäßen und 8er- oder 12er-Strips für einzelne Proben bis hin zu 96- oder 384-well Platten für Hochdurchsatzversuche von standardisierten Prozessen.

Für das Pipettieren einzelner Proben (wässrige Lösungen) ist eine manuelle Einkanalpipette ideal geeignet. Sie  gewährleistet eine sehr genaue und funktionale einmalige Flüssigkeitsaufnahme und -Abgabe für wässrige Lösungen im Mikroliter- bis Milliliter-Bereich. Sie ist das Standardgerät in Routine- und wissenschaftlichen Labors. Eine 8- bzw. 12-Kanal Pipette ermöglicht dagegen  die simultane Ausführung mehrerer Pipettiervorgänge und ist daher bei höherem Probenaufkommen äußerst effizient. Sie eignet sich für den Probentransfer, für Verdünnungsreihen und Waschschritte in Mikrotiterplatten. Neben manuellen Luftpolsterpipetten gibt es auch eine elektronische Variante. Dadurch, dass bei elektronischen Pipetten der Kolben mit Hilfe eines Motors bewegt wird, wird der Daumen beim Pipettieren nicht belastet. Außerdem bieten einige Hersteller verschiedene Pipettiermodi an, wie zum Beispiel den Gel-Modus oder reverses Pipettieren, wodurch bei viskosen, schäumenden oder leicht flüchtigen Substanzen ein genaueres Pipettierergebnis erzielt wird. Auch die Reproduzierbarkeit ist durch den Einsatz elektronischer Pipetten höher, da vom Anwender nicht direkt der Kolben bewegt sondern lediglich ein Knopf bedient wird, der den Kolben gleichmäßig und unabhängig von der Ausführung des Anwenders betätigt. Die Bedienkräfte wirken sich hierbei also nicht auf das Pipettierergebnis aus.

Egal ob manuelle oder elektronische Pipette, die Wahl des optimalen Volumenbereiches bedingt die Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse. Um den Fehler und die Standardabweichung so minimal wie möglich zu halten, sollte möglichst nahe am Nennvolumen gearbeitet werden, da im oberen Volumenbereich die Richtigkeit am Höchsten ist. Es empfiehlt sich also, Pipetten mit verschiedenen Volumenbereichen zur Hand zu haben, um Fehler so gering wie möglich zu halten.

Neben Luftpolsterpipetten stehen dem Anwender auch Direktverdränger zur Verfügung. Doch worin liegt der Unterschied?

Das Verdrängungsprinzip wird häufig für Stepper oder spezielle Direktverdrängerpipetten verwendet. Im Gegensatz zu Luftverdrängersystemen befindet sich der Kolben im Spitzenzylinder und steht somit in direktem Kontakt mit der zu pipettierenden Flüssigkeit. Der Kolben streift die Flüssigkeit bei der Abgabe direkt an der Wand ab. So verlässt auch der letzte Tropfen die Spitze – unabhängig von der Art der Flüssigkeit oder dem Einfluss eines Luftpolsters. Dies ermöglicht hoch reproduzierbare Ergebnisse, auch für „schwierige“ Flüssigkeiten. Doch wann ist der Einsatz eines Direktverdrängers sinnvoll? Folgende Übersicht verdeutlicht die Vorteile und Grenzen der beiden Systeme:

Einfluss von Verbrauchsmaterial auf PCR Ergebnisse

Doch nicht nur die Wahl des passenden Liquid Handling Gerätes, auch die Qualität des Verbrauchsmaterials wirkt sich auf die Verlässlichkeit der PCR Ergebnisse aus. Fremd DNA kann zu falsch positiven Ergebnissen führen, daher muss neben dem Arbeitsplatz auch das Verbrauchsmaterial frei von DNA sein. Die Degradation der Proben kann dagegen zu falsch negativen Ergebnissen führen. Deshalb muss das Verbrauchsmaterial ebenso frei von DNase und RNase sein. An dieser Stelle sollte auch erwähnt werden, dass das Autoklavieren von Verbrauchsmaterial nicht empfohlen wird. Während des Autoklavierens können durch den Dampf  fragmentierte DNA-Moleküle aus Rückständen freigesetzt werden und die Oberflächen kontaminieren. Strahlung hingegen birgt das Risiko, die dünnwandigen Produkte brüchig zu machen und dadurch den Verlust durch Verdunstung zu erhöhen.

Es gibt jedoch noch weitere Faktoren, die das Ergebnis von PCR Ergebnissen beeinflussen können. So stellten u.a. * McDonald G.R. et al. fest, dass die Qualität verschiedener Verbrauchsmaterialien aus Kunststoff Einfluss auf die Ergebnisse von Experimenten ausübte und dass dies auf Substanzen zurückzuführen war, die im Kunststoff enthalten waren und unter hohen Temperaturen freigesetzt wurden (Leachables). Diese Beobachtung wurde in weiteren Veröffentlichungen bestätigt. Es ist daher wichtig darauf zu achten, dass bei der Wahl des Verbrauchsmaterials auf die entsprechende Qualität geachtet wird (z.B. bei BRAND BIO-CERT PCR Quality). BRAND Life Science Verbrauchsmaterial wird unter kontrollierten Bedingungen in einem der weltweit größten Reinräume Deutschlands hergestellt. Ein hohes Maß an Automatisierung stellt die Reinheit des PCR Verbrauchsmaterials bei der Herstellung  sicher.  Außerdem wird eine strenge Eingangskontrolle des Rohmaterials durchgeführt um sicherzustellen, dass das Granulat frei von bioaktiven Substanzen wie den Additiven DiHEMDA und Oleamide ist.  Diese Additive sind häufig in PP Granulat enthalten und können biologische Versuche beeinträchtigen. Es sollte selbstverständlich sein, dass PCR-Verbrauchsmaterial frei ist von DNA, RNase und DNAse. Aber auch hier empfiehlt sich ein Blick auf das Testverfahren des Herstellers (ISO 17 025).

Neben der Qualitätsstufe ist auch eine schnelle und gleichmäßige Wärmeübertragung von entscheidender Bedeutung. Daher zeichnen sich qualitativ hochwertige PCR-Platten durch ein äußerst dünnwandiges Plattendesign der Wells aus, das eine  konstante, schnelle und präzise Wärmeübertragung ermöglicht. Dies wiederum führt zu überzeugenden Ergebnissen und reduziert die Anzahl der PCR-Zyklen. Darüber hinaus minimiert die glatte Innenseite der Wells die Anheftung von Enzymen und Nukleinsäuren.

Verdunstungsschutz

Da das Reaktionsvolumen in PCR Anwendungen sehr klein ist, ist es umso wichtiger, Verdunstung zu minimieren oder wenn möglich komplett zu verhindern. Je besser die PCR Platte und die Verschlussfolie aufeinander abgestimmt sind, desto besser wird eine Verdunstung verhindert.

Folgende Darstellung zeigt, welchen Einfluss ein abgestimmtes System von PCR Platte und Verschlussfolie auf die Verdunstungsrate ausübt:

Wie man unschwer erkennen kann, gibt es im Vergleich zwischen verschiedenen Herstellern durchaus Unterschiede in der Verdunstungsrate. Daher macht es nicht nur Sinn, den PCR-Reaktionsmix zu optimieren, sondern auch einen Augenmerk auf die Auswahl des PCR-Verbrauchsmaterials zu legen.

Vor allem in den Randzonen der Platten ist die Gefahr der Verdunstung deutlich erhöht. Auch hier ist ein abgestimmtes System von Verschlussfolien und PCR Platte ausschlaggebend für einen optimierten Verdunstungsschutz.

Kritische Punkte sind vor allem die Randzonen der PCR-Platten. Diese sind besonders stark von der Verdunstung betroffen. In diesem Versuch wird die Verdunstungsrate in den einzelnen Wells nach einem 4stündigen PCR-Lauf gezeigt.  In  den  rot markierten Felder war die Verdunstung mit bis zu 33% in der links abgebildeten PCR-Platte besonders hoch. In der rechten PCR-Platte dagegen war der Volumenverlust durch Verdunstung deutlich geringer. Diese Versuche zeigen, wie wichtig die Kompatibilität zwischen PCR Platte und Verschlussfolie für den PCR-Lauf und das Ergebnis der PCR ist. Zusätzlich spielt natürlich auch der Druck des Deckels des Thermocyclers eine Rolle. Vor allem für Einzeltubes ist es wichtig vorher abzuklären, wie viele Tubes sich mindestens im Gerät befinden müssen, um einen gleichmäßigen Druck des Deckels zu gewährleisten. Für eine klare Identifikation der Proben bieten sich bunte Reaktionsgefäße an. Bei Platten wird die Gefahr der Probenverwechslung durch die gut lesbare alphanumerische Codierung und die cut corner minimiert.

Um Kreuzkontaminationen zu verhindern, bieten einige Hersteller PCR-Platten mit erhöhtem Wellrand an. Auch dicht sitzende Caps und Verschlussfolien verhindern eine Kreuzkontamination während des PCR-runs. BRAND bietet darüber hinaus zum optimalen Verschließen bzw. Öffnen Hilfsmittel wie den Applikationsspatel zum gleichmäßigen Aufbringen von Verschlussfolien auch auf Platten mit erhöhtem Wellrand, sowie das PCR cap tool an. Bei der Nutzung von PCR-Strips ermöglich eine kleine Lippe an der Seite der einzelnen Gefäße das vorsichtige Abziehen der caps für kontaminationsfreies Öffnen.

Warum Automatisierung?

Für die Automatisierung gibt es auf dem Markt spezielle Platten, die sich durch einen starren Rahmen auszeichnen. Die  Rigid Frame PCR-Platten von BRAND besitzen einen stabilen Polycarbonat-Rahmen, um ein sicheres Handling in halbautomatischen und automatischen Pipettiersystemen und einen optimalen Verdunstungsschutz zu gewährleisten. Der steife Rahmen erlaubt außerdem den Einsatz sehr dünnwandiger Wells aus 100% reinem medizinischem Polypropylen. Die gleichmäßigen und dünnen Wandstärken der Wells sorgen für eine schnelle Übertragung der Temperatur vom Cycler in die Probe und reduzieren so die Zykluszeiten. Verschiedene Rahmenvarianten sorgen für eine gute Passfähigkeit im Thermocycler und somit für eine effiziente Wärmeübertragung. Verschiedene Farben erleichtern die Unterscheidbarkeit der Prozessschritte. Für die qPCR stehen Platten mit weißen Wells zur Verfügung, die die Fluoreszenzsignale bestmöglich reflektieren.

Dort, wo das Arbeiten mit manuellen Pipetten anhand des hohen Probenaufkommens zu mühsam wird, oder Routineabläufe standardisiert ablaufen, ist es sinnvoll, über Automatisierung nachzudenken. Die Liquid Handling Station von BRAND schließt hierbei die Lücke zwischen elektronischer Pipette und einem komplexen Pipettierroboter. Die Vorteile dieses kompakten und zuverlässigen Systems liegen klar auf der Hand: durch die leichte Methodenerstellung durch eine einfache Bedienoberfläche ist der Nutzer selbst in der Lage, Pipettiervorgänge zu programmieren und somit Arbeitszeit zu sparen. Verwechslungen der Samples z.B. beim Probentransfer werden durch die Automatisierung ebenfalls ausgeschlossen. Auch die Genauigkeit und Präzision kann durch den Einsatz eines Liquid Handling Systems verbessert werden.

 

Weitere Informationen

Dieser Blogbeitrag entstand mit freundlicher Unterstützung der Firma BRAND GmbH & Co. KG. Quelle aller Bilder: BRAND GmbH & Co. KG.

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Quellen

* McDonald G.R. et al., Science 322, 917 (2008) Altered hMAO-B activity / inhibition of GABAA binding.